medigraphic.com
ISSN 1561-2988 (Impreso)

2014, Número 2

<< Anterior Siguiente >>

Rev Cubana Farm 2014; 48 (2)


Estandarización de un método espectrofluorométrico para medición de proteasa aspártica secretada (Sap) de Candida albicans

Ramírez ALS, Arias CM, Marulanda OJ

Idioma: Español
Referencias bibliográficas: 24
Paginas: 261-672
Archivo PDF: 456.84 Kb.


RESUMEN

Introducción: la proteasa aspártica secretada (Sap) es considerada un factor de virulencia en el proceso de infección por Candida albicans. La frecuencia de candidiasis a nivel mundial aumenta cada día, razón por la cual se hace necesario encontrar nuevos medicamentos que combatan esta enfermedad, al mismo tiempo desarrollar métodos que evalúen en forma rápida compuestos inhibidores de Sap.
Objetivo: estandarizar un método fluorescente para identificar la inhibición de actividad de Sap.
Métodos: se indujo la producción de Sap en cultivos de C. albicans según la metodología descrita por Capobianco y se evaluaron sus niveles por electroforesis en geles SDS-PAGE en diferentes lapsos de tiempos. La actividad de Sap fue verificada por espectrofluorometría, para lo cual se determinaron las condiciones de reacción, variando las concentraciones de cobre y fluorexon, y los resultados de inhibición, se expresaron como disminución en la señal de fluorescencia. Como control de inhibición de Sap se utilizó Pepstatin A y como control positivo de actividad proteasa se utilizó pancreatina.
Resultados: se establecieron concentraciones de 5,5 y 5,0 µM para fluorexon y cobre respectivamente; el tiempo óptimo de acoplamiento de estos fue de 120 min y la mayor actividad de Sap se alcanzó a las 22 h de incubación.
Conclusiones: las condiciones estandarizadas para el método espectrofluorométrico, permiten confirmar la inhibición de Sap por Pepstatin A y demostrar que es un método viable para evaluar inhibidores de esta proteasa.


REFERENCIAS (EN ESTE ARTÍCULO)

  1. Odds F. Candida species and virulence. ASM News. 1994;60:313-8.

  2. Douglas LJ. Candida proteinases and candidosis. Crit Rev Biotechnol. 1988;8:121-9.

  3. Cutler JE. Putative virulence factors of Candida albicans. Ann Rev Microbiol. 1991;45:187-218.

  4. Ruchel R, de Bernardis F, Ray TL, Sullivan PA, Cole GT. Candida acid proteinases. J Med Vet Mycol. 1992;30(Suppl 1):123-32.

  5. White TC, Kohler CA, Miyasaki SH, Agabian N. Expression of virulence factors in Candida albicans. Can J Botany. 1995;73(S1):1058-64.

  6. Ray TL, Payne CD, Morrow BJ. Candida albicans acid proteinase: Characterization and role in candidiasis. Aspartic proteinase conference on structure and function of the aspartic proteinases: Genetics, structures, and mechanisms. California: Plenum Press; 1990. p. 173-83.

  7. Hube B, Monod M, Schofield DA, Brown AJ, Gow NA. Expression of seven members of the gene family encoding secretory aspartyl proteinases in Candida albicans. Mol Microbiol. 1994;14:87-99.

  8. White TC, Agabian N. Candida albicans secreted aspartyl proteinases: isoenzyme pattern is determined by cell type, and levels are determined by environmental factors. J Bacteriol. 1995;177:5215-21.

  9. Aoki W, Kitahara N, Miura N, Morisaka H, Yamahoto Y, Kuroda K,et al. Candida albicans Possesses Sap7 as a Pepstatin A-Insensitive Secreted Aspartic Protease. PloS One. 2012;7(2): e32513.

  10. Cutfield SM, Dodson EJ, Anderson BF, Moody PC, Marshall CJ, Sullivan PA, et al. The crystal structure of a major secreted aspartic proteinase from Candida albicans in complexes with two inhibitors. Structure. 1995;3:1261-71.

  11. Capobianco JO, Lerner CG, Goldman RC. Application of a fluorogenic substrate in the assay of proteolytic activity and in the discovery of a potent inhibitor of Candida albicans aspartic proteinase. Anal Biochem. 1992;204:96-102.

  12. Goddard JP, Reymond JL. Recent advances in enzyme assays. Trends Biotechnol. 2004;22:363-70.

  13. Breeuwer P, Drocourt JL, Bunschoten N, Zwietering MH, Rombouts FM, Abee T. Characterization of uptake and hydrolysis of fluorescein diacetate and carboxyfluoresceindiacetate by intracellular esterases in Saccharomyces cerevisiae, which result in accumulation of fluorescent product. Appl Environ Microbiol. 1995;61:1614-9.

  14. Lomolino G, Lante A, Crapisi A, Spettoli P, Curioni A. Detection of Saccharomyces cerevisiae carboxy lesterase activity after native and sodium dodecyl sulfate electrophoresis by using fluorescein diacetate as substrate. Electrophoresis. 2001;22:1021-3.

  15. Kierat RM, Kramer R. A fluorogenic and chromogenic probe that detects the esterase activity of trace copper(II). Bioorg Med Chem Lett. 2005;15:4824-7.

  16. Takakusa H, Kikuchi K, Urano Y, Sakamoto S, Yamaguchi K, Nagano T. Design and synthesis of an enzyme-cleavable sensor molecule for phosphodiesterase activity based on fluorescence resonance energy transfer. J Am Chem Soc. 2002;124:1653-7.

  17. Wang Q, Scheigetz J, Roy B, Ramachandran C, Gresser MJ. Novel caged fluorescein diphosphates as photoactivatable substrates for protein tyrosine phosphatases. Biochim Biophys Acta. 2002;1601:19-28.

  18. Gee KR. Novel fluorogenic substrates for acid phosphatase. Bioorg Med ChemLett. 1999;9:1395-6.

  19. Dostal J, Hamal P, Pavlickova L, Soucek M, Rumi T, Pichova I . Simple method for screening Candida species isolates for the presence of secreted proteinases: a tool for the prediction. J Clin Microbiol. 2003;41(2):712-6.

  20. Kathryn Dean ES, Gerard K, Olivier R, Jean-Louis R. A Green Fluorescent Chemosensor for Amino Acids Provides a Versatile High-Throughput Screening (HTS) Assay for Proteases. Bioorg Med Chem Lett. 2003;13:1653-6.

  21. Borg-von Zepelin M, Beggah S, Boggian K, Sanglard D, Monod M. The expression of the secreted aspartyl proteinases Sap4 to Sap6 from Candida albicans in murine macrophages. Mol Microbiol. 1998;28:543-54.

  22. Ruchel R, Tgegeler R, Trost M. A comparison of secretory proteinase from different strains of Candida albicans. Saboraud. 1982;20:233-44.

  23. Schaller M, Krnjaic N, Niewerth M, Hamm G, Hube B, Korting HC. Effect of antimycotic agents on the activity of aspartyl proteinases secreted by Candida albicans. J Med Microbiol. 2003;52:247-9.

  24. Korting HC, Schaller M, Eder G, Hamm G, Bohmer U, Hube B. Effects of the human immunodeficiency virus (HIV) proteinase inhibitors saquinavir and indinavir on in vitro activities of secreted aspartyl proteinases of Candida albicans isolates from HIV-infected patients. Antimicrob Agents Chemother. 1999;43:2038-42.




2020     |     www.medigraphic.com