2023, Número 3
Evaluación antifúngica del ozono contra Candida albicans: estudio in vitro.
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10.35366/111431
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Idioma: Español
Referencias bibliográficas: 23
Paginas: 139-144
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RESUMEN
Introducción: la Candida albicans (C. albicans) es un patógeno fúngico que puede causar infecciones superficiales o potencialmente mortales. Los biofilms de C. albicans muestran rasgos fenotípicos únicos, el más destacado es su notable resistencia a una amplia variedad de agentes antimicóticos. Una de las alternativas para inhibir el crecimiento de este microorganismo es el ozono debido a sus propiedades bactericidas, fungicidas y virucidas; sin embargo, escasa información ha sido reportada en C. albicans. Objetivo: el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto fungicida del ozono en C. albicans. Material y métodos: la metodología consistió en agregar ozono a tubos de ensayo con medios de caldo nutritivo en diversas concentraciones y tiempos de ozonización. El efecto fungicida fue determinado con la determinación del número de colonias de C. albicans en agar nutritivo a través de procedimiento microbiológicos estandarizados por triplicado. Resultados: todas las muestras con ozono mostraron adecuados niveles de inhibición de crecimiento del microorganismo. Además, el efecto fungicida del ozono se encontró para ser significativamente dependiente del tiempo de ozonización y de la concentración. Conclusión: el uso de terapia con ozono podría tener potencial en el control de infecciones micóticas causadas por la presencia de C. albicans.INTRODUCCIóN
El patógeno oportunista Candida albicans (C. albicans) es el hongo más frecuente aislado durante las infecciones orales, varios estudios han demostrado que diferentes bacterias orales se adhieren a este microorganismo en los biofilms orales y pueden modular su patogenicidad. Además, estas interacciones se describen como multidireccionales debido a la presencia de C. albicans u otras Candida spp. y su influencia en el comportamiento de la microbiota bacteriana.1,2
La candidiasis oral es una infección micótica importante en odontología y se deriva de enfermedades subyacentes, xerostomía, uso de prótesis y de antibióticos de amplio espectro, los cuales favorecen el crecimiento excesivo de la colonización endógena de Candida, esto provoca una infección oportunista que impacta seriamente en la alteración de la salud oral.3
Entre las especies de Candida, C. albicans es la principal especie relacionada con la candidiasis oral,4,5 se han propuesto varios factores de virulencia por su patogenicidad. La adherencia a las células epiteliales bucales es un requisito previo esencial para la colonización de la mucosa bucal oral del huésped, mientras que la producción y la secreción de fosfolipasas y proteinasas ayudan a la invasión porque destruyen los componentes de fosfolípidos y proteínas de las membranas de las células del huésped.6
La levadura, C. albicans es un hallazgo frecuente debido a que es un patógeno oportunista en humanos y se puede aislar en 50 a 60% de las cavidades orales de los adultos jóvenes, variando su distribución de acuerdo a diversas condiciones sociodemográficas.7,8 El tratamiento para los diversos tipos de candidiasis usa antifúngicos, principalmente nistatina (ungüento, suspensión oral), miconazol (gel y crema oral), clotrimazol (crema), anfotericina B (pastillas), entre otras.4
La existencia del biofilm de C. albicans puede exacerbar las infecciones clínicas al formar un reservorio para producir células patógenas recalcitrantes, que actúan como semillas para diseminar el organismo al torrente sanguíneo y provocar una infección sistémica invasiva. Además, los biofilms de C. albicans muestran rasgos fenotípicos únicos, el más destacado es que son notablemente resistentes a una amplia variedad de agentes antimicóticos clínicos, incluidos fluconazol y anfotericina B convencional.9
Actualmente, no existen medicamentos específicos para el biofilm de C. albicans, lo que hace que el tratamiento de las infecciones basadas en biofilms sea particularmente problemático.10 El tratamiento exitoso de la candidiasis aún puede ser más obstaculizado donde hay un biofilm establecido y las infecciones por biomateriales siguen siendo un problema cada vez más alarmante debido a su obstinación intrínseca a la terapia convencional;11 por lo tanto, existe una urgencia por desarrollar nuevos agentes antifúngicos contra los biofilms de C. albicans;12 y debido a estas razones es necesario evaluar otras alternativas de tratamiento que ayuden a controlar y eliminar a la C. albicans, responsable de las infecciones micóticas en la cavidad oral.
El ozono es una forma gaseosa incolora de oxígeno y está presente en la atmósfera. Es uno de los gases más importantes en la estratosfera debido a su capacidad para filtrar los rayos ultravioletas, lo cual es crítico para el mantenimiento del equilibrio biológico en la biosfera.13 Por otra parte, se ha utilizado para purificar el agua en todo el mundo durante muchos años, ya que es muy eficaz para eliminar bacterias, hongos, virus y parásitos en una concentración más baja.14 El ozono es un compuesto químico que consta de tres átomos de oxígeno (oxígeno triatómico, O3), una forma energética más alta que el oxígeno atmosférico normal (O2), con un poderoso oxidante.15 También se ha utilizado en medicina y odontología por sus propiedades antimicrobianas basadas en su fuerte efecto de oxidación con la formación de radicales libres, así como en la destrucción directa de casi todos los microorganismos.
En odontología el O3 tiene una amplia aplicación que incluye el tratamiento de lesiones cariosas, desinfección del conducto radicular, cicatrización de heridas después de intervenciones quirúrgicas, control del biofilm de la placa, desinfección de dentaduras postizas, entre otras.14 Algunos estudios han reportado que la forma acuosa de O3 tiene potencial como agente antiséptico, porque genera menos citotoxicidad que el ozono gaseoso o antimicrobianos ya establecidos (digluconato de clorhexidina [CHX]: 2%, 0.2%; hipoclorito de sodio 5.25%, 2.25%; peróxido de hidrógeno (H2O2 al 3%), lo que cumple, además, con las características biológicas celulares óptimas en términos de biocompatibilidad para la aplicación oral.16,17
A pesar de la amplia información disponible en la literatura científica que sugieren el potencial del O3 para el control de diversas infecciones, no existe suficiente información que determine claramente la propiedad antifúngica del O3 contra el microorganismo C. albicans en pruebas in vitro. El objetivo de este estudio fue determinar el nivel antifúngico del O3 contra la C. albicans a través de evaluaciones microbiológicas in vitro.
MATERIAL Y MéTODOS
Preparación de las soluciones con O3
El método de ozonización usado en este estudio fue a través de un trabajo previamente reportado por Peralta y colegas, en el 2017,17 el cual nos sirvió como guía para realizar la ozonificación del medio de cultivo variando exclusivamente el microorganismo a inhibir. Una vez que se tienen preparados los tubos de ensayo, previamente esterilizados y con el medio de cultivo, se les etiquetó con fecha y tiempo de exposición al ozono.
Para la aplicación del ozono se introdujo el aplicador del gas con una aguja al fondo del medio de caldo de cultivo (Standard II-Nährbouillon, Merck), al introducir la aguja empezó el burbujeo e inició también el conteo para su exposición, esto se realizó teniendo el mechero encendido para asegurar la esterilización en un radio de 30 cm. Al término del tiempo sólo se retiró el aplicador y se introdujo a un nuevo tubo ya preparado, se le aplicó el nuevo tiempo y así sucesivamente hasta llegar al último tiempo establecido. El equipo utilizado fue un sistema generador de ozono en corona, de la casa Carbar's (modelo 03AOD).
ACTIVIDAD DE INHIBICIóN DE CRECIMIENTO
Una vez que se tuvieron los tubos con el medio ozonizado el siguiente paso fue la inoculación de la cepa de C. albicans. Ésta se realizó teniendo el mechero encendido para asegurar la esterilización en un radio de 30 cm, con la micropipeta y puntas de 1 μL. Se agitó el medio donde se encontraba la cepa por unos segundos para realizar la toma, una vez obtenida la muestra requerida con la pipeta, se depositó en el medio previamente ozonizado, se cerró el tubo y se desechó la puntilla. Se repitió el proceso nuevamente a cada uno de los tiempos restantes, y así sucesivamente hasta llegar al grupo control positivo (medio nutritivo con microorganismos únicamente), en el cual se realizó una dilución de 1:1,000,000 para lograr hacer el conteo de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL).
Finalmente, 1 μL de cada una de las suspensiones fue extendida en placas con agar nutritivo (MCD LAB), las cuales fueron preparadas por triplicado e incubadas por 24 horas a una temperatura de 37 oC para realizar el conteo de UFC/mL. La actividad de inhibición de crecimiento de la C. albicans fue determinada por el número de UFC/mL y por el porcentaje de inhibición de crecimiento, el cual fue determinado por una proporción del número de UFC/mL del grupo control positivo y las UFC/mL obtenidas por los diversos grupos de O3.
ANáLISIS ESTADíSTICO
Los resultados de la actividad de inhibición de crecimiento fueron expresados en promedio, desviaciones estándar y porcentajes de acuerdo con las UFC/mL. El análisis entre grupos se realizó con el análisis de t de Student para grupos independientes paramétricos y las diferencias entre grupos fueron determinadas cuando p < 0.05. El programa estadístico utilizado fue IBM-SPSS Statistics versión 25.
RESULTADOS
Los resultados de acuerdo a los tiempos de ozonización, así como la concentración de O3 en la inhibición de C. albicans está descrita en la Tabla 1. En general, la actividad de inhibición de crecimiento de la C. albicans se presentó a partir de los 350 y 400 s en una concentración de O3 de 0.0494 y 0.0564, respectivamente.
En la Tabla 2 se muestran los resultados del nivel de inhibición en el crecimiento de la C. albicans con O3. Una vez identificado el tiempo y concentración de O3 en la cual comienza la inhibición del crecimiento del microorganismo, se realizaron evaluaciones usando tiempos de ozonización de 320, 340 y 350 s. El tiempo de ozonización fue dependiente de la concentración de O3, en el cual la concentración de ozono aumentó gradualmente con el avance del tiempo de ozonización (320 s = 0.0451 ppm, 340 s = 0.0479 ppm y 350 s = 0.0494 ppm).
Por otro lado, el uso de ozono generó diferentes niveles de inhibición de la C. albicans para todos los grupos. Aunque se puede apreciar un efecto de inhibición de crecimiento que aumenta gradualmente con el tiempo de ozonización y la concentración de O3, el nivel de inhibición de crecimiento de la C. albicans fue estadísticamente mejor en todos los tiempos de ozonización y concentraciones de ozono (940 ± 45.8, 664 ± 98.3 y 0 ± 0 UFC/mL, respectivamente), en comparación con el grupo control positivo (2,097,333 ± 54,601 UFC/mL) (p < 0.05). Adicionalmente, se puede observar que los porcentajes de inhibición de crecimiento de la C. albicans aumentaron con la presencia del O3, así como en sus tiempos de ozonización y concentraciones más altas.
En la Figura 1 se muestran imágenes representativas de placas de agar nutritivo de C. albicans expuestas a ozono. Las imágenes de la placa de agar nutritivo muestran mayor cobertura de colonias de C. albicans en tiempos de ozonización y concentraciones más bajas (Figura 1A), seguidas de las condiciones de O3 moderadas (Figura 1B), en las cuales se observan menor cantidad de colonias que en las concentraciones más bajas. Finalmente, el grupo con la ausencia total de colonias de C. albicans fue encontrado en los tiempos de ozonización y concentraciones de O3 más altos (Figura 1C). Indudablemente, los resultados de la actividad de inhibición de crecimiento de la C. albicans dependen firmemente de la presencia, tiempo de ozonización y concentración de O3.
DISCUSIóN
El presente estudio demostró que el uso de ozono tiene un efecto de inhibición en el crecimiento de C. albicans bajo condiciones in vitro, el cual se encontró estadísticamente asociado con el tiempo de ozonización y con la concentración del ozono en las soluciones. Estos resultados podrían sugerir el uso del ozono como una terapéutica potencial para el control de infecciones orales fúngicas asociadas con C. albicans.
Hoy en día, existen cuatro principales tipos de fármacos antimicóticos para la mayoría de las infecciones, considerados como terapia tradicional farmacológica: los azoles, polienos, equinocandinas y análogos de nucleósidos. Los azoles (fluconazol) son los más recetados para infecciones micóticas sistémicas y tópicas. Los polienos (anfotericina B) son los fungicidas más antiguos disponibles para tratar infecciones graves. Las equinocandinas (caspofungina) son fungicidas contra la mayoría de las especies de Candida, son la clase más nueva de antifúngicos para tratar infecciones persistentes mediante la administración intravascular. Los análogos nucleósidos como la 5-flucitosina son antimetabolitos que limitan a los nucleósidos durante la síntesis de ácidos nucleicos interrumpiendo la síntesis de ARN, ADN y proteínas de los hongos.18 Sin embargo, las infecciones por C. albicans suelen ser resistentes a la mayoría de las terapias farmacológicas convencionales.9
Existen terapias alternativas que han demostrado ser eficaces para el control de la C. albicans, por ejemplo, el uso de la curcumina como un fármaco anticandidial y que suele ser eficaz por la escasa solubilidad que presenta. Se ha sugerido que el tratamiento de la C. albicans se maneje en combinación con otros métodos, como la terapia fotodinámica, la cual ha demostrado ser mínimamente invasiva para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades.
La combinación de dos agentes antifúngicos con diferentes mecanismos de acción, como la química y la terapia fotodinámica, para complementar las deficiencias de uno y otro tratamiento, ha mostrado tener un efecto positivo en los pacientes.19 No obstante, otros estudios han comprobado que la combinación de la terapia de ozono y la fotodinámica no ofrecen una reducción adecuada de microorganismos que se encuentran sobre un biofilm bien estructurado.20
En la presente investigación observamos la inhibición del crecimiento de C. albicans por medio del contacto del O3 a distintas concentraciones (0.0451, 0.0479 y 0.0494 ppm, respectivamente) y tiempos de generación en su forma gaseosa (320, 340 y 350 s). Es probable que el ozono haya generado reacciones a nivel molecular en el medio acuoso, al producir una oxidación de las paredes celulares y las membranas citoplasmáticas en el microorganismo de C. albicans y crear una permeabilidad aumentada para que las moléculas de ozono logren entrar adecuadamente, lo que da como resultado un daño físico en las estructuras superficiales de las células.20,21
Otros estudios también han demostrado efectos antifúngicos contra la C. albicans. El uso de productos naturales para el control de enfermedades micóticas ha obtenido resultados favorables mediante la interrupción de algunos mecanismos de acción, tal es el caso de los inhibidores de la síntesis de componente de la pared celular (quitina y manoproteínas), inhibidores de la síntesis de esfingolípidos (serina palmitoiltransferasa, ceramida sintasa, inositol fosfoceramida sintasa) e inhibidores de la síntesis proteica (sordarinas).
Otros autores han demostrado el control de C. albicans mediante el uso de productos naturales derivados de plantas como el pinoresinol que despolariza y forma poros en la membrana fúngica o mediante el uso del aceite de canela y el complejo del aceite de "pogostemon" que provoca irregularidades porosas en la superficie de C. albicans.19
En otros estudios se ha demostrado la efectividad de las burbujas de ozono con una concentración aproximada de 10 ppm como limpiador de dentaduras protésicas contra la C. albicans, al mostrar una reducción de hasta una décima parte en 30 min de exposición.22 En este estudio, la inhibición en el crecimiento C. albicans se mostró a partir de una exposición de 350 s a una concentración de ozono de 0.0494 ppm y a los 400 s con una concentración de 0.0564 ppm. Es bien sabido que el ozono posee la capacidad de tener una alta solubilidad por su gran facilidad de dispersarse en el agua y provocar una reacción en los ácidos grasos insaturados de la membrana fosfolípida que desencadena todo un proceso que conlleva a la liberación de oxígeno y causa la muerte de microorganismos.17
Debido a las limitaciones y deficiencias mostradas por los tratamientos convencionales, se ha optado por la búsqueda de nuevas alternativas de tratamiento que puedan generar efectos beneficiosos en el paciente y que no comprometan el estado de salud de éste. La ozonólisis es un proceso por el cual se lleva a cabo una oxidación de las células al generar irregularidades en las paredes citoplasmáticas y promover la destrucción de las paredes celulares, lo que da como resultado una mayor permeabilidad del microorganismo.20
El presente estudio demuestra la eficacia del ozono en una forma gaseosa contra la C. albicans y, al igual que otros gases como el O2, NO y CO, ha evidenciado tener una eficacia contundente; sin embargo, es necesario conocer las limitaciones con respecto a sus dosis y tiempos de exposición para evitar que se convierta en una opción terapéutica con repercusiones toxicas.23
A pesar de que diferentes microorganismos se encuentren establecidos en un mismo entorno, la variable con respecto a los tipos de administración, las dosis y los tiempos de exposición dependerán del tipo de microorganismo específico por el cual se esté realizando el tratamiento.17 El presente estudio ofrece al clínico un punto de partida basado en evidencia científica con respecto a las concentraciones adecuadas para el manejo de las enfermedades micóticas, pero no establece un protocolo generalizado debido a que el diseño de este estudio fue in vitro, lo que sugiere que se deben realizar futuras investigaciones de tipo clínico, además se debe seguir investigando el beneficio del ozono para el tratamiento de diferentes enfermedades y la búsqueda de diferentes alternativas para distintos procedimientos terapéuticos.
CONCLUSIONES
Este estudio demostró que el ozono posee un efecto antifúngico significativo contra el microorganismo C. albicans bajo procedimientos in vitro, el cual es dependiente del tiempo y concentración durante la ozonización. Aunque el ozono podría representar una terapéutica antifúngica potencialmente efectiva para el control de infecciones micóticas orales asociadas con C. albicans, es necesario el desarrollo de nuevos protocolos de investigación para determinar el uso seguro en seres humanos.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al Departamento de Estomatología del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) y al Programa para el Desarrollo Profesional Docente (PRODEP) por su apoyo en el desarrollo de este estudio.
REFERENCIAS (EN ESTE ARTÍCULO)
Peralta ER, Vázquez GFJ, Portilla R et al. Efecto antimicrobiano de la terapia con ozono contra Streptococcus sanguis como tratamiento preventivo de enfermedad periodontal: estudio in vitro. Rev Mex Periodontol. 2017; 7 (3): 84-92. [Accessed June 4, 2018] Disponible en: http://www.medigraphic.com/cgi-bin/new/resumen.cgi?IDARTICULO=72651&IDPUBLICACION=7070&IDREVISTA=212&NOMBRE=Revista Mexicana de Periodontolog%EDa
AFILIACIONES
1 Especialidad de Periodoncia, Departamento de Estomatología. Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Ciudad Juárez, Chihuahua, México.
2 Licenciatura en Biología. Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Ciudad Juárez, Chihuahua, México.
3 Maestría en Ciencias Odontológicas, Departamento de Estomatología. Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Ciudad Juárez, Chihuahua, México.
4 Especialidad de Ortodoncia, Departamento de Estomatología. Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Ciudad Juárez, Chihuahua, México.
CORRESPONDENCIA
Dr. en C. León Francisco Espinosa-Cristóbal. E-mail: leohamet@hotmail.comRecibido: 20 de enero de 2021. Aceptado: 03 de mayo de 2023.