Zúñiga RY, Villegas VCA, Torres RB, Hernández RE

Idioma: Español
Referencias bibliográficas: 18
Paginas:
Archivo PDF: 455.81 Kb.

RESUMEN

Introducción: La citometría de flujo permite la cuantificación de las subpoblaciones de linfocitos con una elevada sensibilidad, especificidad y objetividad. Estas ventajas solo se logran con un proceso laborioso de diseño individualizado y controlado para cada experimento.
Objetivo: Diseñar un protocolo de un solo tubo policromático de citometría flujo para inmunofenotipo linfocitario periférico.
Métodos: Se realizó un estudio experimental in vitro con muestras de sangre periférica obtenidas de tres voluntarios sanos, en el Centro Nacional de Genética Médica, en marzo de 2019. El tubo se compuso de seis marcadores de linaje para identificar linfocitos B, T, natural killer y natural killer T. Se desarrolló un protocolo de lisis de hematíes sin lavado. Se emplearon anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos. El punto óptimo de concentración correspondió al mayor índice de tinción y conservación de los porcentajes de positividad de cada población. Se realizó la construcción progresiva del tubo y se propuso una estrategia lógica de secuencia de ventanas para el análisis de datos.
Resultados: Los marcadores seleccionados permitieron realizar correctamente el inmunofenotipo linfocitario periférico. En los cinco puntos de titulación se observaron buenas discriminaciones entre las señales positivas y negativas, excepto para el anti-CD56 que presentó una tendencia decreciente del índice de tinción. El volumen total de conjugados requeridos para la determinación de los 6 antígenos fue de 3,75 μL por tubo.
Conclusiones: Se obtuvo un tubo policromático que permite el inmunofenotipo periférico de forma rápida y precisa por seis antígenos linfocitarios simultáneamente, con el empleo de pequeños volúmenes de conjugado y sangre.

REFERENCIAS (EN ESTE ARTÍCULO)

1. Kanegane H, Hoshino A, Okano T, Yasumi T, Wada T, Takada H, et al. Flow cytometry-based diagnosis of primary immunodeficiency diseases. Allergol Int. Jan 2018;67(1):43-54.

2. Sileikiene V, Laurinaviciene A, Lesciute-Krilaviciene D, Jurgauskiene L, Malickaite R, Laurinavicius A. Levels of CD4+ CD25+ T regulatory cells in bronchial mucosa and peripheral blood of chronic obstructive pulmonary disease indicate involvement of autoimmunity mechanisms. Adv Respir Med. 2019;87(3):159-66.

3. Santiago F, Lima S, Antunes S, Silvestre RT, Scherrer LR, Alves G, et al. Imunophenotypic evaluation as a tool for monitoring risks for blood malignancies in gas station workers. Asian Pac J Cancer Prev. 2019;20(7):2109-15.

4. Majumder MM, Leppä AM, Hellesøy M, Dowling P, Malyutina A, Kopperud R, et al. Multi-parametric single cell evaluation defines distinct drug responses in healthy hematological cells that are retained in corresponding malignant cell types. Haematologica. Jun 2020;105(6):1527-38. Prepublished online 22 Aug 2019. doi: 10.3324/haematol.2019.217414

5. Adan A, Alizada G, Kiraz Y, Baran Y, Nalbant A. Flowcytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 2017 Mar;37(2):163-76.

6. van Dongen JJ, van der Burg M, Kalina T, Perez-Andres M, Mejstrikova E, Vlkova M, et al. EuroFlow-Based Flow cytometric Diagnostic Screening and Classification of Primary Immunodeficiencies of the Lymphoid System. Front Immunol. 2019;10:1271.

7. van der Burg M, Kalina T, Perez-Andres M, Vlkova M, Lopez-Granados E, Blanco E, et al. The EuroFlow PID Orientation Tube for Flow Cytometric Diagnostic Screening of Primary Immunodeficiencies of the Lymphoid System. Front Immunol. 2019;10:246.

8. Collino CJ, Rodríguez C, Sastre D, Heller V, Fernández E. Utilización estratégica de CD45 en la identificación de células blásticas por citometría de flujo. Acta Bioquím Clín Latinoam. 2006;40(2):173-80.

9. Van Acker1 HH, Capsomidis A, Smits EL, Van Tendeloo VF. CD56 in the immune System: More than a marker for cytotoxicity? Front Immunol. 2017;8:892.

10. Finak G, Langweiler M, Jaimes M, Malek M, Taghiyar J, Korin Y, et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping analysis from the Human Immunophenotyping Consortium. Sci Rep.2016;6:1-11.

11. Mateus J, Lasso P, González JM, Puerta CJ, Cuellar A. Diseño de un panel multicolor para evaluar moléculas intracelulares y de superficie mediante citometría de flujo. Biomédicas. 2013;33:660-72.

12. Winsor M. A simple no-wash method for the flow cytometric enumeration of leukocyte subsets in whole blood. MACS&more. 2012 [acceso 15/08/2019];14(1):26-9. Disponible en: Disponible en: https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0010012.PDF

13. Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, Akdis M, Andrä I, Annunziato F, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. Eur J Immunol. 2017;47:1584-797.

14. Wang L, Hoffman RA. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 2017;79:1.3.1-1.3.27. doi: 10.1002/cpcy.14

15. Büscher M. Flow cytometry instrumentation-an overview. Curr Protc Cytom 2019;87(1):e52.

16. Dieye TN, Vereecken C, Diallo AZ, Ondoa P, Diaw PA, Camara M, et al. CD4 T-Cell Counting in Resource-Poor Settings. J Acquir Immune Defic Syndr 2005;39:32-7.

17. Schnizlein-Bick CT, Mandy FF, O'Gorman M, Paxton H, Nicholson J, Hultin LE, et al. Use of CD45 gating in three and four-color flow cytometric immunophenotyping: guideline from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, division of AIDS. Cytometry (Clin Cytometry) 2002;50:46-52.

18. MACS Miltenyi Biotec. 7-Color Immunophenotyping Kit human. 2017 [acceso: 02/09/2019]. Disponible en: Disponible en: http://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0006957.PDF